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一、目的要求
1．学习细菌的染色技术和无菌操作技术。
2．巩固显微镜的使用方法。
二、基本原理
单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。
在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以常用碱性染料进行染色。碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易与带负电荷的细菌结合而使细菌着色。例如，美蓝（亚甲蓝）实际上是氯化亚甲蓝盐（methylene blue chloride,缩写为MBC），它可被电离成正、负离子：
MBC methylene blue+﹢chloride-
带正电荷的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。常用的碱性染料除美蓝外，还有结晶紫（crystal violet）、碱性复红（basic fuchsin）、番红（又称沙黄，safranine）等。
细菌体积小，较透明，如未经染色常不易识别，而经着色后，与背景形成鲜明的对比，易于在显微镜下进行观察。
三、器材
显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶，擦镜纸，生理盐水，玻璃铅笔，吸水纸，试管架，火柴，小烧杯，酒精瓶等；
吕氏碱性染色液，石炭酸复红染色液；金黄色葡萄球菌菌种，枯草芽孢杆菌菌种。
四、操作步骤
1．涂片 取两块干净的载玻片，各滴一小滴生理盐水于载玻片中央，严格按无菌操作程序（图1），分别挑取金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌于二载玻片的水滴中（每一种菌制一片），调匀并涂成薄膜。注意滴生理盐水时不宜过多，涂片必须均匀，挑取菌种时切勿将培养基挑破。
图1 无菌操作及制片过程
2．干燥 于室温中自然干燥。
3．固定 涂片面向上，于火焰上通过2—3次，使细胞质凝固，以固定细菌的形态，并使其不易脱落。但不能在火焰上烤，否则细菌菌体变形。
4．染色 放标本于水平位置，滴加染色液于涂片薄膜上，染色时间长短随不同染色液而定。吕氏碱性美蓝染色液约染2—3分钟，石炭酸复红染色液约染1—2分钟。
5．水洗 染色时间到后，用自来水冲洗，直至冲下之水无色时为止。注意冲洗水流不宜过急，过大，水由玻片上端流下，避免直接冲在涂片处。冲洗后，将标本晾干或用吹风机吹干，待完全干燥后才可置油镜下观察。
6．显微镜观察
利用低倍镜、高倍镜和油镜观察细菌的个体形态。
五、实验报告
1．绘出你所观察到的经单染色的两种细菌形态图。
2．根据实验体会，你认为制备染色标本时，应注意哪些事项？
2．制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察？
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