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实验八细菌的革兰氏染色法
一、目的要求
1．了解细菌革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的制片技术。
2．观察细菌的各种形态结构。
3．巩固课堂知识，增强感性认识。
二、基本原理
革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料(basic dye)初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet）。媒染剂的增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95%的酒精（ethanol）。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群。
三、器材
大肠杆菌菌种（1号菌种），枯草芽孢杆菌菌种（2号菌种）；革兰氏染色的四种染液，载玻片，显微镜，接种环，双层瓶，擦镜纸，生理盐水或无菌水，玻璃铅笔，吸水纸，火柴，小烧杯，酒精瓶，酒精灯，试管架，摄子等。
四、操作步骤
1．涂片前在载玻片上做标记。
2．涂片 本实验采用“三区”涂片法。在载玻片的左右两端，各加1滴水，严格按无菌操作程序，用无菌接种环挑取少量1号菌种与左边水滴充分混合成仅有1号菌的区域，并将少量菌液由左向右延伸至玻片的中央，把接种环上残留的菌烧掉。再用无菌的接种环挑取少量2号菌种与右边水滴充分混合成仅有2号菌的区域，并将少量菌液由右向左延伸至玻片的中央，使1号菌和2号菌在玻片的中央混合成含有两种菌的混合区。
3．干燥和固定 涂片自然干燥后，手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，玻片在微火上通过3—4次（用手指触涂片反面，以不烫手为宜），待冷却后再加染液。（注意涂片不可过于浓厚）
4．染色
（1）初染 加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。
（2）媒染 滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。
（3）脱色 将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20—30秒钟，立即用水冲净酒精。
（4）复染 用番红液染1—2分钟，水洗。
（5）镜检 干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。
革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。
五、实验报告
1．在你所作的革兰氏染色制片中，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌各染成何色？它们是革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌？图示菌体形态。
2．作革兰氏染色涂片时为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么？
3．当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？
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