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实验九 显微镜直接计数法
一、目的要求
1．明确显微镜计数的原理。
2．学习使用血球计数板进行微生物计数的方法。
二、基本原理
利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。此法的优点是直观、快速。将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的（0.1㎜3），所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。
血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。
计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，共400小格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格，总共也是400小格。所以无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的。
每一个大方格边长为1㎜，则每一大方格的面积为1㎜2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1㎜，所以计数室的容积为0.1㎜3。其计算方法如下：
1．16×25的计数板计算公式
细胞数 ml=(100小格内的细胞数 100)×400×1000×稀释倍数
2．25×16的计数板计算公式
细胞数 ml=(80小格内的细胞数 80)×400×1000×稀释倍数
三、器材
酵母菌悬液，血球计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管等。
四、操作步骤
1．稀释
将酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。
2．镜检计数室
在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗后才能进行计数。
3．加样品
将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），使菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。静置5—10分钟即可计数。
4．显微镜计数
将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有5—10个菌体为宜。若选用25×16规格的计数板则每个计数室选5个中方格，可选4个角和中央的中格（即80个小格），若选用16×25规格的计数板，则数四个角：左上、右上、左下、右下的四个中方格，（即100小格）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。
5．清洗血球计数板
使用完毕后，将血球计数板在水笼头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其化沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。
五、实验报告
1．将结果记录于下表中。A表示五个中方格中的总菌数；B表示菌液稀释倍数。
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各中格中菌数 |
A |
B |
菌数/ml |
二室平均值 |
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1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
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第一室 |
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第二室 |
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2．为什么用两种不同规格的计数板测同一样品时，其结果一样？
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